大脑中成千上万的神经回路是大脑处理复杂感觉信息并产生相应行为的基础。哺乳动物大脑中细胞特异性神经回路的分析是神经科学的重要研究内容。

2022年5月6日，加州大学旧金山分校(UCSF)的段鑫教授发表了一篇关于自然神经科学的文章。神经连接蛋白引导的选择性哺乳动物视网膜神经节突触的跨SEQ成像基于五年的跨突触连接，开发了一种新的单细胞测序技术。

针对该技术，回答以下问题:

(1)眼睛中的神经细胞如何识别其在大脑中对应的突触后细胞，进而形成一个巨大的神经网络；

(2)形成这些一对一特定突触的分子机制是什么。

小鼠视觉系统是研究哺乳动物神经回路的极好模型。视网膜中各种神经节细胞的形态、功能和转录组学都比较深入，对视网膜神经回路的研究也比较成熟。然而，关于视网膜到大脑视觉相关区域的长距离投射的研究却很少。视网膜神经节细胞如何与大脑中的神经元连接，这些特定的突触是如何形成的，以及这种连接传递了什么独特的视觉信息，仍然是未解之谜。

这是因为要实现细胞类型分辨率的神经回路远程跟踪，还有一系列严格的技术瓶颈需要突破。现有的顺行单突触技术仍存在许多难以克服的缺点，如病毒毒性高、电生理记录困难或与细胞特异性遗传标记不兼容等。因此，低毒性、单组分、跨突触和体内荧光成像示踪剂有望出现。

加州大学旧金山分校的研究人员发明了一个名为trans-SEQ的技术平台，成功克服了长距离环路追踪过程中遇到的诸多技术难题，实现了除视觉系统以外的多个脑区细胞类型的横向连接组学研究。基于这些技术突破，他们进一步研究了从视网膜到上丘的特定神经回路，揭示了指导这一回路形成的新的分子机制。

Trans-Seq结合了两种技术:顺行神经环路追踪技术和高通量测序技术。起初，他们利用基因工程对麦胚凝集素(WGA)进行修饰，筛选出一种特异性融合蛋白产物mWGA-mCherry (mWmC)。用AAV感染特定的靶细胞类型后，可以实现顺行单突触的追踪。然后，他们通过单细胞RNA-Seq技术分析了跨突触荧光标记的突触后神经元的细胞亚型，从而实现了连接组学和转录组学的结合。

起初，他们将Trans-Seq技术应用于小鼠的视网膜-上丘回路。在用红色荧光标记的视网膜神经节细胞下游的细胞的单细胞测序中，他们将接受视网膜投射的上丘中的细胞分为三种类型的兴奋性神经元和五种类型的抑制性神经元。

这结合了连接组学和转录组学的结果，不仅发现了接受视网膜投射的神经元的三个新的分子标记，而且揭示了从视网膜中的神经节细胞(RGC)到上丘神经元亚型的特异性突触连接图。

通过生物信息学的预测，他们还发现了视网膜α神经节细胞(αRGC)与上丘中肾连接蛋白阳性的宽树突神经元(NPWF)之间的突触联系。这一结果也通过伪狂犬病病毒示踪和光生理学辅助的电生理学实验平行验证。

为了进一步揭示这种神经连接网络的分子形成机制，他们还通过对Trans-Seq产生的单细胞转录组数据库的深入分析，发现了一种细胞外基质蛋白Nephronectin，这是αRGC到NPWF神经元突触识别所必需的特异性分子。肾连接蛋白是第一个报道的控制哺乳动物视网膜到大脑突触连接特异性的分子。

他们还发现了整合素α8β1和肾连接素在突触前的相互作用。进一步的分子、遗传学和电生理实验证明，αRGC中的整合素α8β1和NPWF神经元中的肾连接素在指导轴突选择和分层形成特异性突触中起着重要作用。这一发现将给相关眼科和神经系统疾病的诊断和治疗带来启示。

这项研究工作为研究哺乳动物神经回路创造了新的思路——提供了从转录组到连接组的有效过渡，加速了这一热点领域的发展。除了视觉系统，麻省理工学院的王凡教授还将这种追踪技术应用于从皮层到纹状体的环路研究，证明了这种技术作为环路开发工具的普适性和实用性。加州大学旧金山分校的几个实验室目前正在合作探索跨SEQ技术在不同大脑区域和生物物种中的使用和其他功能。他们认为，这项技术将对神经科学、基因组学、系统和分子神经科学产生深远影响，在再生医学中具有广泛的应用潜力。